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タンパク

タンパク質の抽出・精製 | 電気泳動と各種 |ウエスタンブロッティング |酵素活性測定 |二次元電気泳動 |ペプチドマッピング |N末端アミノ酸配列分析 |アミノ酸組成分析 |抗体作製と特異性の検定 |分子間相互作用解析 |HPLC ELISA |質量分析

タンパク分析フローチャート

タンパク質の抽出・精製 

組織、細胞、微生物などから目的タンパク質を抽出します。対象タンパク質の性質と、抽出後の目的に合わせて様々な抽出方法がありま す。さらなる精製が必要な場合には、精製後の用途に応じて様々な方法を組み合わせることになりますので、ある程度の時間が必要となります。事前に分離や検 出方法、費用や期間などについて綿密な打ち合わせをおこないます。また随時進捗状況をお知らせし、必要に応じて協議をおこないます。

電気泳動と各種染色

試料調整から電気泳動(SDS-PAGE,Native-PAGE,IEF,2D-PAGE)、染色(CBB、銀、PASなど)までの一連の作業を予備検討の段階からおこないます。

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ウエスタンブロッティング

 電気泳動によって分離されたタンパク質を膜に転写後、目的のタンパク質に特異的な抗体を用いた検出や、アミノ酸配列分析などを行います。膜やゲル板、一般的な2次抗体なども用意してあります。

酵素活性の測定 

酵素活性測定法の確認や検討、保存や安定化条件の検討、分画や部分精製の必要性、サンプルの測定までを一つ一つ確認しながら行います。また活性測定法の確立にも可能な限り対応いたします。 尚、場合によっては検討にかなりの時間を必要とする場合があります。

二次元電気泳動 

一次元目の等電点電気泳動にはpH固定ゲルストリップ(Immobiline、8~24cm)を使います。二次元目のSDS-PAGEは最大6枚まで同時に泳動することができます。染色は、CBB、銀、SYPRO Rubyなどにより行います。泳動後のスポット解析ソフトもありますので、ご相談ください。

質量分析

 単一のスポットまたは精製タンパク質をトリプシンなどのタンパク質分解酵素で消化し、MALDI-TOF-MSでフラグメントを測定し、データベースから同定します。また、さらに、そのフラグメントをMS/MS解析した同定も可能です。

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ペプチドマッピング  

電気泳動後の単一タンパク質や、精製されたタンパク質をトリプシンなどのタンパク分解酵素によって断片化し、逆相クロマトグラフィによって分画、分取します。

N末端アミノ酸配列分析    

エドマン分解法によって、N末端から順次アミノ酸を切り出し、HPLCで分析します。事前に試料の状態や分析希望サイクル、費用や期間などについて綿密な打ち合わせをおこないます。ご要望があれば、得られた配列でホモロジー検索もします。

アミノ酸組成分析    

単一タンパク質またはペプチドを酸加水分解によってアミノ酸まで分解し、AccQTag法で定量分析をおこないます。

抗体作製と特異性の検定   

動物実験部門と連携してウサギを用いたポリクローナル抗体を作製します。 免疫から 採血、血清分離、力価測定、特異性の検定をして抗血清をお渡しできます。

抗体の各種標識    

血清、腹水、培養上清からIgG、IgMなどを精製し、各種蛍光、酵素標識(FITC,Alexa, HRP,Biotinなど)を行います。

ELISA  

市販のキットを用いたELISA測定をおこないます。  またELISA系の作製については、ご相談をお受けします。

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分子間相互作用解析

BIACORE3000を使って、分子の結合(相互作用)をリアルタイムに測定することができます。センサーチップ上のリガンド-レセプ ター、抗原-抗体、核酸-タンパク質、タンパク質-タンパク質などの結合状態をリアルタイムにモニターできます。結合の有無や結合・解離定数を求めること ができます。また結合した物質を回収することも可能です。事前に綿密な打ち合わせをおこない、測定条件検討、測定、解析などを研究者と協議しながら進めま す。

分子間相互作用解析例

HPLC

おもにタンパク質以外の低分子の分析、定量に使用します。事前に分離や検出方法、費用や期間などについて綿密な打ち合わせをおこないます。 進捗状況などは適時報告します。吸光(紫外、可視、フォトダイオードアレイ)、蛍光、電気化学、化学発光検出器を設置してあります。冷却機能の付いたオー トサンプラーやフラクションコレクターもあります。タンパク質分取用にはAKTAexplorerを低温室内に設置しています。

カラムクロマトグラフィー

HPLCはおもにタンパク質以外の低分子の分析、定量に使用します。事前に分離や検出方法、費用や期間などについて綿密な打ち合わせをおこないます。 進捗状況などは適時報告します。吸光(紫外、可視、フォトダイオードアレイ)、蛍光、電気化学、化学発光検出器を設置してあります。冷却機能の付いたオートサンプラーやフラクションコレクターもあります。タンパク質分取用にはAKTAexplorerを低温室内に設置しています。

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