TOPに戻る サイトマップ | お問い合わせ

DNA

 ゲノムDNA抽出PCR産物精製プラスミドDNA精製DNAシークエンスPCR | 次世代シークエンス

DNA解析フローチャート図

ゲノムDNA抽出法

血液、組織、培養細胞などから目的に応じたDNAの抽出をおこないます。またパラフィン切片からのDNA抽出もおこないます。

  • 全血からの抽出(PCR用、1ml以下)
    1. Triton X-100による溶血
    2. グアニジン塩酸による可溶化
    3. アルコール沈殿
  • 全血からの抽出
    1. 塩化アンモニウムによる溶血またはデキストランによる白血球分離
    2. RNase A、Proteinase K 処理
    3. フェノール/クロロフォルム抽出
    4. アルコール沈殿
  • Tailからの抽出
    1. Proteinase K 処理
    2. フェノール/クロロフォルム抽出
    3. アルコール沈殿
  • 培養細胞・組織からの抽出
    1. ホモジネート
    2. RNase A、Proteinase K 処理
    3. フェノール/クロロフォルム抽出
    4. アルコール沈殿
  • パラフィン切片からの抽出
    1. レモゾールによるパラフィン除去
    2. Proteinase K 処理
    3. フェノール/クロロフォルム抽出
    4. アルコール沈殿
チャート図に戻る

PCR産物の精製法

  • PCR反応液からの抽出
    1. 高塩濃度溶液による希釈
    2. ガラスビーズまたはスピンカラムへの吸着
    3. 洗浄
    4. 回収
  • アガロースゲルからの抽出
    1. ヨウ化ナトリウムによる溶解
    2. ガラスビーズまたはスピンカラムへの吸着
    3. 洗浄
    4. 回収
  • アガロースゲルからの抽出 簡易法
    1. 中和フェノール中で細粉
    2. 凍結
    3. TE抽出
    4. アルコール沈殿
チャート図に戻る

プラスミドDNA精製法

キットなどによる高純度プラスミドの抽出をおこないます。

  • 簡易精製-1 (少量から大量精製)
    1. 集菌
    2. SDS/NaOH 処理後 中和
    3. ガラスビーズまたはスピンカラムへの吸着
    4. 洗浄
    5. 回収
  • 簡易精製-2 (大量精製)
    1. 集菌
    2. SDS/NaOH 処理後 中和
    3. フィルター濾過
    4. 限外濾過膜による遠心濃縮
  • 高純度精製 (大量精製)
    1. 集菌
    2. SDS/NaOH 処理後 中和
    3. アルコール沈殿
    4. LiCl 処理
    5. アルコール沈殿
    6. PEG 沈殿
    7. フェノール/クロロフォルム抽出
    8. アルコール沈殿

チャート図に戻る

DNAシークエンス

依頼は月曜日と木曜日午前11時までにお願いします。その日が休祭日の場合は翌日に受け付けます。精製したテンプレートとプライマー、DNAシークエンス申込書に必要事項を記入してお持ちください。通常翌日には結果とお預かりしたテンプレート、プライマーをお返しできます。

BigDye Terminator v3.1 でラベルしABI 3500XL で分析します。50cm 24本キャピラリーですので、一度に24検体を約1時間で分析します。したがって昼ころからラベリング反応をおこない、脱塩、乾燥、フォルムアミド溶解、夕方から分析を開始すれば翌朝までに2プレート(192サンプル)の分析をこなす事ができます。テキストデータ、エレクトロフェログラムの結果をEmailやUSBなどの保存媒体でお返しします。

テンプレートについて

プラスミドは1分析あたり200から600ナノグラム必要です。PCR産物の目安として5から50ナノグラム必要です。アガロースゲルではっきり確認できたバンドを切り出し、スピンカラムで精製すれば、およそ10回分は回収できます。テンプレートはできるだけきれいなものをご用意ください。共雑物によっては反応を阻害し、得られるデータに影響を与える場合があります。 

プライマーについて

1分析あたり3pmolを使用します。3μM(3pmol/μl)程度の濃度に調整したものをお持ちください。支援センターには、M13-Forward、M13-Reverse、T3、T7、SP6の5種類を用意してあります。

DNAシークエンス申込書について

テンプレートとプライマーの組み合わせを1分析とします。従って1つのテンプレートについてフォワードとリバースプライマーでシークエンスをする場合は2分析となります。

結果について

プリントしたエレクトロフェログラム(およそ600ベースまで)と配列のテキストファイルや生データを、お持ちいただいたUSBメモリーに入れてお返しします。Emailに添付してお送りすることも可能です。結果に疑問や不満のある時は遠慮無くおっしゃってください。再解析、再泳動、アニーリング温度を変えた再分析など納得いただけるように対応します。 急ぎの方や大量シークエンスをご希望の方はご相談ください。 またサンプル調整から結果の解析まで殆どの事についてお手伝いできますのでご相談ください。

チャート図に戻る

PCRについて

プライマーの設計からPCR条件の検討も含め、目的遺伝子の増幅をおこないます。

  • プライマーの設計 (情報科学部門)
    1. データベースなどから目的の配列を取得
    2. プライマーの塩基数、PCR産物のサイズなどから候補となるプライマーの組み合わせを探す 
    3. 候補プライマーの配列でデータベースサーチをおこなう
    4. 最適の配列を決定
    5.     
        
  • PCR条件検討
    1. グラジエント機能の付いたサーマルサイクラーでアニーリング温度を決定
    2. PCR産物をアガロース電気泳動でサイズ確認
    3. 必要があればシークエンサーで配列確認

チャート図に戻る

次世代シークエンス Ion PGM

医学部ではLife technologies社の次世代シーケンサIon PGMシステムが稼働しており、当センターがサンプルの調製から、機械のオペレーションとデータ解析をサポートしています。

Ion PGM シーケンサは半導体チップ型のマイクロチップを利用して、ポリメラーゼによってDNAが伸長する際に放出される水素イオンの濃度を半導体チップ上で検出し、塩基配列データに変換します。

Copyright (C) 2015東海大学伊勢原研究推進部 生命科学統合支援センター. All Rights Reserved.